總局關于發布《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》食品補充檢驗方法的公告（2017年第75號）

發布日期：2019-07-14 20:36:44 來源：互聯網

發布單位	國家食品藥品監督管理總局國家食品藥品監督管理總局	發布文號	2017年第75號
發布日期	2017-06-15	生效日期	2017-06-15
有效性狀態		廢止日期	暫無
屬性	通告公告	專業屬性	檢驗檢疫
備注	http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0087/174048.html

　　按照《食品補充檢驗方法工作規定》，《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》食品補充檢驗方法已經國家食品藥品監督管理總局批準，現予發布。

　　特此公告。

　　附件：植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定（BJS 201707）

　　食品藥品監管總局

　　2017年6月15日

　　附件

　　植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定BJS 201707

　　1 范圍

　　本方法規定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鑒定的實時熒光PCR方法。

　　本方法適用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等復合植物蛋白飲料中標識含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的檢測及鑒定。

　　2 原理

　　提取試樣中基因組DNA，以DNA為模板，利用物種特異性引物及探針進行實時熒光PCR擴增檢測，同時設置陽性、陰性及空白對照。根據擴增的Ct值，判定試樣中是否含有該源性成分。

　　3試劑和材料

　　除另有規定外，試劑為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB 6682的要求。所有試劑均用無

　　DNA酶污染的容器分裝。

　　3.1核桃源性成分Jugr2基因檢測用引物對序列為：

　　核桃5’端引物：5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’

　　核桃3’端引物：5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’

　　核桃探針：5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’

　　3.2花生源性成分Ara b2基因檢測用引物（對）序列為：

　　花生5’端引物：5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’

　　花生3’端引物：5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’

　　花生探針：5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’

　　3.3 杏仁源性成分Prudul基因檢測用引物（對）序列為：

　　杏仁5’端引物：5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’

　　杏仁3’端引物：5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’

　　杏仁探針：5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3’

　　3.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因檢測用引物（對）序列為：

　　芝麻5’端引物：5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’

　　芝麻3’端引物：5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’

　　芝麻探針：5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3’

　　3.5榛子源性成分oleosin基因檢測用引物（對）序列為：

　　榛子5’端引物：5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’

　　榛子3’端引物：5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’

　　榛子探針：5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3’

　　3.6大豆源性成分Lectin基因檢測用引物（對）序列為：

　　大豆5’端引物：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’

　　大豆3’端引物：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’

　　大豆探針：5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3’

　　3.7真核生物18SrRNA內參照檢測用引物（對）序列為：

　　內參照5’端引物： 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’

　　內參照3’端引物： 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’

　　內參照探針：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3’

　　3.8 CTAB緩沖液：55 mmol/L CTAB，1400mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，

　　用10%鹽酸調節pH 至8.0，121℃高壓滅菌20 min, 備用。

　　3.9 蛋白酶K：20mg/mL。

　　3.10苯酚：氯仿：異戊醇（體積比：25:24:1）。

　　3.11 異丙醇。

　　3.12 70%乙醇。

　　3.13 Taq DNA聚合酶。

　　3.14 dNTP混合液。

　　3.15 TE緩沖液（Tris-HCl、EDTA緩沖液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。

　　3.16 10×PCR緩沖液：200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）。

　　4儀器和設備

　　4.1 組織研磨器。

　　4.2 核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。

　　4.3 恒溫水浴鍋。

　　4.4 離心機：離心力12,000g。

　　4.5 微量移液器（0.5μL~10μL，10μL~100μL，10μL~200μL，100μL~1000μL）。

　　4.6 實時熒光PCR儀。

　　4.7 渦旋振蕩器。

　　4.8 天平：感量0.01g。

　　5分析步驟

　　5.1 試樣總DNA的提取

　　固體樣品：將樣品粉碎后稱取0.3~0.6 g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取試劑盒提取DNA。

　　液體樣品：取1 mL 樣品于Eppordorf管中，加入1 倍體積的異丙醇，混合均勻，室溫下沉淀5 min，室溫下以12,500 rpm 離心5 min，棄去上清液。重復此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA，也可用等效商品化DNA提取試劑盒提取DNA。

　　（1）將處理后的樣品加入2 mL離心管中，加入600 μL CTAB緩沖液和40 μL蛋白酶K溶液，振蕩混勻，65℃孵育1 h（過夜孵育更好），期間每隔10 min振蕩混勻；

　　（2）加入500 μL的苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），振蕩抽提10 min，室溫下以12,500 rpm 離心10 min；

　　（3）小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇，振蕩均勻，12,500 rpm 離心10 min；

　　（4）棄去上清液，用65℃預熱的TE緩沖液溶解DNA；

　　（5）小心吸取上清，加入200 μL氯仿：異戊醇（24:1），振蕩抽提，室溫下以12500 rpm 離心15 min；

　　（6）小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇，振蕩均勻，12,500rpm 離心10 min；

　　（7）棄去上清液，沉淀用70% 乙醇洗滌，離心1min，晾干，溶于50μLTE 緩沖液中。

　　5.2 DNA濃度和純度的測定

　　取1μL DNA溶液，使用核酸蛋白分析儀檢測其濃度及質量，OD260/280值應在1.7~1.9之間時，適宜于PCR擴增。

　　5.3 實時熒光PCR擴增

　　反應體系總體積為25μL，其中10×PCR緩沖液5μL，正反向引物（10μmol/L）各1μL，探針（10μmol/L）1μL，dNTPs（10μmol/L）2μL ，Taq DNA聚合酶（2.5U）0.2 μL，DNA模板（10-100ng/μL）2μL，用滅菌去離子水補足至總體積25μL。真核生物內參照的反應體系同上，僅替換相應的引物和探針。也可使用相應的商品化擴增試劑盒。

　　反應參數：50℃ 2min； 95℃ 15min； 95℃ 15s， 60℃ 1min， 40個循環。

　　5.4 實驗對照

　　檢驗過程分別設陽性對照、陰性對照、空白對照。以相應植物源物種提取的DNA為陽性對照，以已知不含該植物源的物種DNA為陰性對照，以滅菌水為空白對照。樣品、內參照和對照設置兩個平行的反應體系。

　　6結果判斷與表述

　　6.1 質量控制

　　以下條件有一條不滿足時，結果視為無效：

　　（a）空白對照：無FAM熒光信號檢出；

　　（b）陰性對照：無FAM熒光信號檢出；

　　（c）陽性對照：有FAM熒光信號檢出，且FAM通道出現典型的擴增曲線，Ct值≤35.0；

　　（d）內參對照：有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值＜30.0。

　　6.2 結果判定

　　（a）如Ct值≤35.0，則判定為被檢樣品陽性；